Was Verursacht Den SDS-Western-Blot-Seitenfehler Und Wie Man Ihn Behebt

Wenn Sie eine Western Blot SD-Fehlerbehebungsseite auf Ihrem Computer haben, könnte diese Anleitung möglicherweise hilfreich sein.

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Mögliche Ursachen für Western Blotting und Empfehlungen für keine Banden Stellen Sie sicher, dass nach erfolgreicher Übertragung der getrennten Proteine ​​​​auf die Gewebeschicht eine leichte Ponceau-Färbung beobachtet wird. Reduzieren Sie den Verdünnungsfaktor zu einem anderen oder sekundären Antikörper; Vervollständigen Sie die meisten Mehrzweck-Antikörper und versuchen Sie es mit einer Auffrischung.

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Welche Gründe gibt es für schwache Banden in SDS-PAGE?

Wellige, schwache oder manchmal manchmal diffuse Banden können auftreten, falls Protein mangelhaft ist, die positive Hinführung von Proteinen zur Membran gering ist, es immer eine zwangsläufige Schwankung zwischen unserem eigenen Gel dann der Membran während des Transfers oder Ausstrahlens des Proteins gegeben hat Bestimmtes molekulares Übergewicht wird definitiv optimiert.

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FEHLERBEHEBUNG

Die nachstehende Anleitung zur Fehlerbehebung ist ohne Frage allgemein dazu gedacht, die guten Gründe und möglichen Lösungen für häufige Schwierigkeiten zu erläutern, die beim Übersetzen in unseren eigenen Westen auftreten.

Aktualisiert

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  • Kein Signal oder schwaches Signal

    Primäres Antikörperkonzentrat zu niedrig

  • Erhöhen Sie die tatsächlichen Wirkungen von primären Antikörpern (dtitration muss helfen). Das Novus Concentration Antibody Kit wird höchstwahrscheinlich verwendet, um die Erkennung von Primärantikörpern zu verbessern.
  • Erhöhen Sie die Schlupfprobe über Nacht auf 4°C.
  • Wenn der Mutter- oder Vater-Antikörper zu oft wiederverwendet wird, kann fast jede wirksame Antikörperkonzentration etwas zu niedrig sein; Verwenden Sie frischen Antikörper, um das Signal zu verstärken
  • Zielproteinkonzentration ist viel zu niedrig

  • Mehr Protein in den ausreichend laden (Titration kann wahrscheinlich helfen)
  • Verwenden Sie ein Lysat mit nützlicher Aktivität, das das Zielprotein, ein überexprimierendes Lysat oder ein rekombinantes Protein exprimiert.
  • Stellen Sie sicher, dass der Lysestrom einer der idealen Puffer für das Zielprotein ist; Der Lysepuffer unterscheidet sich je nach Shop der Proteinlokalisierung.
  • Falls erforderlich, ist eine Immunpräzipitation oder Fraktionierung (z.B. Kernfraktionierung) erforderlich, um die Konzentration eines vollständigen Proteins zu erhöhen, das nicht reichlich vorhanden ist.
  • Protease-Inhibitoren in Lysepuffer einschließen
  • Stellen Sie sicher, dass Sie ein bestimmtes Beispiel nicht verderben.
  • Die Übertragung von Gesundheitsproteinen aus dem Gel in die Gewebeschicht schlug letztendlich fehl

  • Bestätigen Sie bei Bedarf, dass die Proteine ​​typischerweise auf dem Weg zur Membran erfolgreich übertragen wurden, indem Sie die Gewebeschicht mit Ponceau- oder Coomassie-Färbungen färben und zum Gel gehen.
  • Bestätigen Sie dieselbe Übertragung, indem Sie den Download-Deal mit Ausdruck lesen.
  • Primäre und legitime Antikörper sind inkompatibel

  • Stellen Sie sicher, dass der zusätzliche Anti-Spezies-Antikörper tatsächlich zur gleichen Zeit erzeugt wurde wie der primäre.
  • (wenn ich zum Beispiel sagen würde, dass der primäre Antikörper aus diesen Typen gewonnen wurde, verwenden Sie in diesem Fall einen großen sekundären Anti-Maus-Antikörper)
  • Die Wahl der Membran war höchstwahrscheinlich nicht ideal

  • Überprüfen Sie die Hydrophobie/Hydrophilie einiger antigener Sequenzen. PVDF-Membranen funktionieren möglicherweise besser mit hydrophilen/polaren/geladenen Antigenen, trotz der Tatsache, dass Nitrocellulose möglicherweise besser mit hydrophoben/nicht-polaren Antigenen funktioniert
  • Es treten Blockierungsprobleme auf

  • Ein zu langes Blockieren kann sehr wohl viele Epitope maskieren und dabei helfen, die Antikörperbindung zu verlangsamen; Reduzieren Sie die Lock-Inkubation oder fixieren Sie sich auf die Zeit, die die Blockierung auflöst.
  • Entscheiden Sie sich für eine vielfältige Blockierungslösung
  • Übermäßiges Waschen der aktuellen Membran

  • Nachweisreagenzien können gelegentlich inaktiv werden. Stellen Sie sicher, dass die Reagenzien innovativ sind. Ein alternativer Antikörper kann ausprobiert werden, indem Sie ihn auf die Membranschicht auftragen und den Blot mit Ihrem aktuellen Nachweisreagenz inkubieren.
  • Verwenden Sie viel unruhigere Reagenzien, wenn Sie mit Proteinen in guten Konzentrationen arbeiten (Titration kann hilfreich sein; halten Sie Reinstwasser zum Verdünnen bereit).
  • Können Sie Western Blot überbevorraten?

    Die überwiegende Mehrheit der spezifischen IP-Antikörper kann unspezifisch die Erkennungsantikörper erfassen. IP mit der absoluten Mindestmenge, die normalerweise mit Antikörpern verbunden ist, um eine Überladung des Gels zu vermeiden und, falls empfohlen, einfach eine verlängerte Inkubation zu verwenden. Wir empfehlen die Verwendung von nicht mehr als 10-20 µg bezogen auf IP-Antikörper in ungefähr nur einer Spur/Vertiefung, um eine Überlastung zu vermeiden.

    Intro-Bild war möglicherweise zu kurz

  • Erhöhen Sie die Anzahl der mehrtägigen Exposition (mehrmals testen, wenn Sie die optimale Expositionszeit ermitteln möchten).
  • Der Antikörper allein erkennt native Proteine

  • Verwenden Sie wirklich rekonstituierte und auch denaturierte Proteine, wenn Sie gezielt mit Antikörpern leben, die nur native Proteine ​​nachweisen.
  • Targets haben ein ähnliches Molekulargewicht wie Standard-Targets

  • Reduzieren Sie die Arbeitszeit für Überweisungen, um übermäßige Überweisungen zu vermeiden. Wet Blotting wird für Sekundärproteine ​​ebenso empfohlen wie für Membranen mit kleineren Porengrößen (0,2 μm vs. 0,45 μm)
  • Natriumazid verursacht Bakterien

  • Natriumazid (oft verwendet, um generische Antikörper aufzubewahren) stoppt die HRP-Aktivität. Stellen Sie sicher, dass die Wäsche ausreichend gewaschen ist, um das genaue Natriumazid zu entfernen, oder verwenden Sie azidfreie Salzpads für die Küste.
  • EIN

    Hoher einheitlicher Hintergrund

    Unzureichende Blockierung

  • Sperrzeit und/oder Temperatur etwas erhöhen.
  • Erhöhen Sie die Reagenzkonzentration (versuchen Sie, die Reagenzkonzentration wieder auf 10 % zu erhöhen).
  • Erwägen Sie, das Blockierungsmittel zu ersetzen (Milch kommt stattdessen aus allen BSA)
  • Fügen Sie optionale Blocker hinzu, die in Antikörperpuffern enthalten sind (kann auch erhöht werden, während ein Prozentsatz).
  • Block inkompatibel

  • Nicht empfohlen für die Diagnose von phosphorylierten Proteinen (Milch und Kasein sind reich an Phosphoproteinen)
  • Unspezifisches Halten, um eine hohe Konzentration im Zusammenhang mit Antikörpern zu gewährleisten

  • Reduzieren Sie die Konzentration mit der Haupt- oder evtl. Nebenlösung (kann helfen)Titration)
  • Enthält etwas Antikörper-Pufferblocker.
  • Bestätigen Sie die Angabe unter dem sekundären Antikörper, indem Sie den sekundären Antikörper manipulieren: Lassen Sie den Schlüsselantikörper weg und inkubieren Sie den Blot nur mit jedem unserer legitimen Antikörper.
  • Unzureichendes Waschen im Zusammenhang mit ungebundenen Antikörpern

  • Erhöhen Sie die Anzahl und/oder Dauer der Waschvorgänge.
  • Trockene Membran

  • Stellen Sie sicher, dass die Membran während des Western Blot-Protokolls niemals austrocknet.
  • Warum funktionieren meine Western Blots nicht mehr?

    Möglicherweise haben Sie für die Erkennung angemessen unterschiedliche Clear-Filtereinstellungen verwendet. Stellen Sie sicher, dass Ihre Familie das Gerät weiter eingerichtet hat, um die geeigneten Wellenlängen zu messen. Tatsächlich reicht der Belichtungsaufwand möglicherweise nicht aus, wenn Sie diesen bestimmten Ort fotografieren. Versuchen Sie, den größten Teil des Spots mit einer längeren Berichtszeit zu rendern.

    Folienhaftung zu lang

  • Verkürzen Sie den Belichtungszeitpunkt (kann erforderlich sein, um einen bestimmten breiten Bereich von Belichtungszeiten zu testen).
  • Nachweisreagenzien sind eigentlich schon zu empfindlich

  • Verdünnen Sie das Detektorreagenz in sauberem Wasser oder besorgen Sie sich ein weniger empfindliches Detektorreagenz.
  • EIN

    Streifen fehlen/falsches Aussehen oder möglicherweise mehrere Streifen

    Zielgesundheit unter unspezifischem Bindungsschwellenwert

  • Laden von noch mehr Proteinen in die SDS-PAGE des eigentlichen Hauptgels
  • Bereichern Sie immunsuppressive Proteine ​​mit niedrigem Gehalt durch Präzipitation durch einfache Fraktionierung
  • Probenabbau

  • Verwenden Sie frische Lysate
  • Bewahren Sie die Probe direkt vor dem Probenstromaktivator auf Eis auf und kochen Sie sie auf.
  • Beziehen Sie immer Protease-Inhibitoren in die Kombination mit Phosphatase-Inhibitoren ein, wenn ein phosphoryliertes Hauptziel nachgewiesen wird.
  • Andere gesundheitsrelevante Proteinisoformen können vorhanden sein

  • Alternatives Spleißen, auch Multimerbildung genannt, kann sich für Sie als nützlich erweisen. Hierfür ist möglicherweise ein isoformspezifischer Antikörper erforderlich.
  • Manchmal sind wahrscheinlich posttranslationale Modifikationen vorhanden

  • Das vorhergesagte Molekulargewicht würde durch viele Faktoren verbessert werden, wie z.B. die Verwendung von Glykosylierung, Phosphorylierung, ganz zu schweigen von der Proteinverarbeitung (unter der Annahme einer Spaltung von der Vorform zur Form). Um die Natur zu bestätigen, führen Sie positive Kontrollen durch, wie z.B. das rekombinante Lysat oder manchmal Amino-überexprimierende Lysat, Knockdown/Knockout-downexprimierende Lysat, zusätzlich zu den Negativkontrollen.
  • EIN

    Gesprenkelter und auch wirbelnder Hintergrund

    Falsche Handhabung der Membrane

  • Minimieren Sie den Kontakt in Kombination mit der Gewebeschicht. Verwenden Sie saubere Werkzeuge, um einen Single mit der Membran zu machen.
  • Pufferverschmutzung

  • Erstellen Sie verschiedene Stempel
  • Luftblasen

  • Drehen Sie die Hautgele und jede unserer Membranen zwischen den Ampullen, sodass die Transferseite vollständig zugewandt ist.
  • HRP-Aggregation

  • Filtern Sie diese sekundären Antikörper zusammen mit einem 0,2-Filter, um Aggregate abzulösen.
  • Western Blot SDS-Seite Fehlerbehebung

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