Qué Causa El Error De La Página SDS Western Blot Y Cómo Solucionarlo

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Posibles causas del Western Blot y recomendaciones para no bandas Verifique que después de la transferencia exitosa que incluye las proteínas separadas a la capa de tejido, se observa una ligera tinción de Ponceau. Reducir el factor de dilución uno al anticuerpo particular o secundario; Complete la mayoría de los anticuerpos de uso múltiple e intente actualizar.

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Congelar página SDS

Transferencia de proteínas necesarias del gel a la membrana

Detección de inmunotransferencia

Limpieza y resondeo de la membrana

¿Qué produce bandas tenues en SDS-PAGE?

Bandas onduladas, débiles o a veces difusas pueden aparecer en caso de deficiencia de proteína, la ejecución positiva de proteínas a la membrana debe ser baja, siempre ha habido fluctuación de tensión emocional entre nuestro propio gel y la membrana durante la transferencia o el progreso, la proteína un cierto molecular unas pocas libras está definitivamente optimizado.

Transferir almacenamiento

Mostrar casi todos los registros

SOLUCIÓN DE PROBLEMAS

La guía de solución de problemas a continuación tiene la intención, literalmente, de explicar las marcas y las posibles soluciones a las tribulaciones comunes que ocurren cuando se traduce al Oeste real.

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  • Sin señal o señal insegura

    Interés del anticuerpo primario demasiado bajo

  • Aumenta el objetivo real de los anticuerpos primarios (la dtitulación debería ayudar). El Novus Concentration Antibody Kit ciertamente debe usarse para aumentar el punto focal de los anticuerpos primarios.
  • Eleve el ejemplo de eclosión a 4 °C durante la noche.
  • Si el anticuerpo de la madre o el padre se reutiliza demasiadas veces, prácticamente cualquier concentración efectiva de anticuerpos puede ser tan baja; use anticuerpos nuevos para aumentar la señal
  • La concentración de proteína objetivo a veces es baja

  • Cargar más proteína en el excelente (la titulación probablemente pueda ayudar)
  • Utilice un lisado de actividad segura que exprese la proteína deseada, un lisado que sobreexprese o una buena proteína recombinante.
  • Asegúrese de que la carga de lisis sea uno de los amortiguadores insuperables para la proteína objetivo; El tampón de lisis difiere según el ctr de localización de la proteína.
  • Si es necesario, obtenga los beneficios de la inmunoprecipitación o el fraccionamiento (como el fraccionamiento de fischer) para aumentar la concentración de una proteína fabulosa que no es abundante.
  • Incluir inhibidores de la proteasa en el tampón de lisis
  • Asegúrese del hecho de que una muestra en particular no se estropee.
  • La transferencia de proteína saludable del gel a la capa de tejido finalmente falló

  • Si es necesario, confirme que las proteínas se transfirieron con éxito para ayudar a la membrana tiñendo la capa de la membrana con tinciones de Ponceau o Coomassie, recomendando el gel.
  • Confirme la misma reubicación leyendo la copia impresa dominante de la descarga.
  • Los anticuerpos primarios y legítimos son incompatibles

  • Asegúrese de que el anticuerpo anti-especie adicional probablemente se generó al mismo tiempo que el principal.
  • (por ejemplo, si a menudo el anticuerpo primario se obtuvo al matar ratones, en este caso, use este anticuerpo secundario anti-ratón)
  • La elección de la membrana inicialmente no fue la ideal

  • Compruebe la hidrofobicidad/hidrofilicidad de la secuencia antigénica. Las membranas de PVDF pueden funcionar mejor con antígenos hidrofílicos/polares/cargados, la verdad es que la nitrocelulosa puede funcionar mejor con antígenos hidrofóbicos/no polares
  • Suele haber problemas de bloqueo

  • El bloqueo demasiado prolongado tiene la capacidad de enmascarar muchos epítopos y bloquear la unión de anticuerpos; Reduzca la incubación de bloqueos o concéntrese realmente en el tiempo de bloqueo resuelto.
  • Busca una solución de bloqueo increíble
  • Lavado excesivo de la membrana actualmente

  • Los reactivos de detección pueden volverse inactivos durante días. Asegúrese de que los reactivos estén crudos. Se puede evaluar un anticuerpo alternativo aplicándolo a la capa de la membrana e incubando la mancha con el reactivo de detección actual.
  • Use reactivos mucho más hipersensibles cuando trabaje con proteínas en concentraciones muy bajas (la titulación puede ayudar; comience con agua ultrapura para diluir).
  • ¿Puedes exagerar el Western blot?

    La gran mayoría de los cuales el anticuerpo IP puede capturar de forma no específica cómo el anticuerpo de reconocimiento. IP con la cantidad requerida normalmente asociada con anticuerpos para evitar realmente la sobrecarga de gel y simplemente depender de una incubación prolongada si se recomienda. No podemos vivir sin usar no más de 10-20 µg vinculados con anticuerpos IP en aproximadamente cada carril/pocillo para evitar la sobrecarga.

    La imagen de introducción podría haber sido demasiado corta

  • Aumente el número de programas de exposición (pruebe varias veces cuando necesite determinar el tiempo de exposición óptimo).
  • El anticuerpo definitivo reconoce proteínas nativas

  • Realmente use proteínas reconstituidas junto con desnaturalizadas si se gana la vida con anticuerpos que solo determinan proteínas nativas.
  • Los objetivos tienen un peso molecular más bajo que los objetivos estándar

  • Reduzca la transferencia un poco de tiempo para evitar transferencias excesivas. Se recomienda la transferencia húmeda para proteínas secundarias, incluso para membranas con tamaños de poro diminutos (0,2 μm frente a 0,45 μm)
  • La azida de sodio provoca bacterias

  • La azida de sodio (a menudo utilizada para almacenar anticuerpos genéricos) mantiene bajo control la actividad de HRP. Asegúrese de que la ropa esté lo suficientemente lavada como para eliminar la azida de sodio, o use almohadillas de sal de río sin azida.
  • A

    Fondo alto uniforme

    Bloqueo insuficiente

  • Aumente ligeramente el tiempo y/o la temperatura de bloqueo.
  • Aumente el conocimiento de los reactivos (intente aumentar la concentración de reactivos hasta un 10 %).
  • Considere reemplazar el agente bloqueador (leche en lugar de BSA)
  • Incluya bloqueadores opcionales contenidos en los tampones de anticuerpos (también se puede aumentar en forma de porcentaje).
  • Bloqueo incompatible

  • No recomendado para sensores de proteínas fosforiladas (leche y por eso la caseína es rica en fosfoproteínas)
  • Presentación no específica para garantizar una alta concentración de anticuerpos

  • Reducir la concentración con la solución principal o incluso una secundaria (puede ayudar) titulación)
  • Contiene el agente bloqueador del tampón de anticuerpos.
  • Confirme la indicación del anticuerpo secundario manipulando, diría yo, el anticuerpo secundario: omita el anticuerpo inicial e incube la mancha solo con esos anticuerpos legítimos.
  • Lavado insuficiente de anticuerpos no unidos

  • Aumenta el número y/o la duración junto con los lavados.
  • Membrana seca

  • Asegúrese de que la membrana nunca se deshidrate durante el protocolo Western Blot.
  • ¿Por qué mis transferencias occidentales definitivamente funcionan?

    Es posible que haya utilizado una configuración de filtro Borrar diferente para la detección. Asegúrese de que su familia haya configurado más arriba el dispositivo para medir las longitudes de onda válidas. De hecho, el tiempo libre de exposición puede no ser suficiente al tomar fotografías de este lugar en particular. Intenta renderizar cada punto con un tiempo directo más largo.

    Adherencia de la película demasiado larga

  • Reduzca el tiempo de exposición (puede ser necesario probar una amplia gama importante de tiempos de exposición).
  • Los reactivos de detección suelen ser demasiado sensibles

  • Diluya el reactivo del detector en agua limpia o utilice un reactivo de detección menos sensible.
  • A

    Franciscas de franjas/tipo incorrecto o posiblemente múltiples franjas

    Aminoácidos objetivo por debajo del umbral de unión no específica

  • Cargar más y más proteínas en SDS-PAGE de su gel real
  • Enriquecer proteínas inmunosupresoras de bajo contenidoPrecipitación mediante el proceso de fraccionamiento
  • Degradación de la muestra

  • Usar lisados ​​frescos
  • Guarde la muestra para hielo justo antes de cargar la muestra y hervir.
  • Siempre incluya inhibidores de la proteasa en combinación con inhibidores de la fosfatasa cuando se detecte un gran objetivo fosforilado.
  • Pueden estar presentes otras isoformas de proteínas de la salud

  • El empalme alternativo, también conocido como formación de multímeros, puede resultarle útil. Esto puede deberse a un anticuerpo específico de isoforma.
  • A veces pueden presentarse modificaciones postraduccionales

  • Es posible que el peso molecular predicho deba mejorarse por muchos factores, como el uso de glicosilación, fosforilación y, como resultado, el procesamiento de proteínas (suponiendo que la escisión incluya la preforma para formar). Para confirmar la naturaleza, ejecute controles positivos, como otro lisado recombinante o, a veces, lisado con sobreexpresión de carne, lisado con expresión descendente/desactivada, en suma a los controles negativos.
  • A

    Fondo moteado o arremolinado

    Manipulación incorrecta de algunas de las membranas

  • Minimice el contacto en combinación con la capa de tejido. Use herramientas limpias para hacer una cosa con la membrana.
  • Contaminación amortiguadora

  • Crear sellos para principiantes
  • Burbujas de aire

  • Voltea los geles para la piel y la membrana misma entre las ampollas mirando completamente la transferencia.
  • Agregación de HRP

  • Filtre estos anticuerpos secundarios que incluyen un filtro 0.2 para deshacerse de los agregados.
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