Quelles Sont Les Causes Que Vous Voyez, L’erreur De Page SDS Western Blot Avec Comment Y Remédier

Si quelqu’un a une page de résolution de problèmes Western Blot SD sur votre ordinateur, ce kit pourrait vous aider.

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Causes possibles, y compris Western Blot et recommandations pour l’absence de bandes Vérifiez qu’après un changement réussi des protéines séparées à cette membrane, une légère coloration de Ponceau est reconnue. Réduire le facteur de dilution celui qui sera un ou des anticorps secondaires ; Complétez plusieurs anticorps réutilisables et essayez de rafraîchir.

Liens connexes

Guide de plongée Western

Guide de dépannage

Il est recommandé de prendre les commandes

Préparation des échantillons

western absorber le dépannage de la page sds

Bloquer la page SDS

Transfert impliqué avec des protéines du gel à la membrane

Immunoblot donc détection

Nettoyage et resondage de la membrane

Qu’est-ce qui pousse les bandes faibles dans SDS-PAGE ?

Des bandes ondulées, mauvaises ou parfois diffuses peuvent apparaître lorsque la protéine est déficiente, la liaison utile des protéines à la couche tissulaire est faible, il y a toujours dernièrement une fluctuation de pression entre notre propre gel de blanchiment des dents et la membrane pendant le transfert et / ou peut-être le transfert, le protéine un poids moléculaire garanti est définitivement optimisé.

Stockage de transfert

Afficher essentiellement tous les journaux

DÉPANNAGE

Le guide de dépannage perd du poids. est généralement destiné à expliquer les causes particulières et les solutions possibles à des problèmes simples qui surviennent lors de la traduction vers enfin l’Occident.

Mise à jour

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  • Aucun signal ou signal bon marché

    Concentration d’anticorps primaire trop faible

  • Augmenter la concentration substantielle d’anticorps primaires (le titrage devrait vraiment aider). Le kit d’anticorps Novus Concentration peut être utilisé pour augmenter la concentration d’anticorps primaires.
  • Augmentez généralement le spécimen à éclosion à 4 °C pendant la nuit.
  • Si l’anticorps du père ou de la mère est réutilisé pendant trop d’années, toute concentration efficace d’anticorps peut parfois être trop faible ; utiliser un anticorps frais pour amplifier le signal
  • La concentration cible en protéines est sans aucun doute également faible

  • Charger plus de protéines dans un puits (le titrage peut probablement aider)
  • Utilisez le lysat à activité positive réelle qui exprime comment la protéine cible, un lysat surexprimant ou éventuellement une protéine recombinante.
  • Assurez-vous que tout le tampon de lyse est l’un des bons tampons pour la protéine cible ; Le tampon de lyse diffère en fonction de ce centre particulier de localisation des protéines.
  • Si nécessaire, s’appuyer sur l’immunoprécipitation ou le fractionnement (comme le fractionnement nucléaire) pour augmenter la concentration liée à une protéine qui n’est plus abondante.
  • Inclure des inhibiteurs de protéase dans le tampon de lyse
  • Assurez-vous qu’un échantillon particulier ne sera pas gâché.
  • Le transfert des protéines liées du gel vers leur membrane a finalement échoué

  • Si nécessaire, confirmez quels experts déclarent que les protéines ont été mises en compte avec succès sur la membrane en colorant la membrane avec des taches disgracieuses de Ponceau ou de Coomassie, pointant vers le gel.
  • Confirmez le transfert en lisant le téléchargement gardez le contrôle sur l’impression.
  • Les anticorps primaires et légitimes finissent par être incompatibles

  • Assurez-vous que l’anticorps anti-espèce supplémentaire continue d’être généré au même laps de temps que l’anticorps principal.
  • (par exemple, si vous pensez que l’anticorps primaire a été obtenu grâce à des souris, dans ce cas, utilisez tous les anticorps secondaires anti-souris)
  • Le choix de la couche de tissu n’était pas idéal

  • Vérifier l’hydrophobicité/hydrophilie relative à la séquence antigénique. Les membranes PVDF fonctionneront probablement mieux avec des antigènes hydrophiles/polaires/chargés, même si la nitrocellulose peut mieux fonctionner maintenant avec des antigènes hydrophobes/non polaires
  • Il y a des problèmes de blocage

  • Un blocage trop long peut masquer de nombreux épitopes et bloquer la liaison des anticorps ; Réduisez l’incubation des verrous et ne vous concentrez pas sur le temps de résolution des blocages.
  • Optez pour la solution de blocage unique en particulier
  • Lavage excessif de votre membrane actuelle

  • Les réactifs de détection peuvent devenir inactifs une fois terminé. Assurez-vous que les réactifs sont souvent frais. Un autre anticorps peut être testé en l’appliquant généralement sur la membrane et en incubant le blot avec le réactif de détection.
  • Utilisez des réactifs beaucoup plus réactifs lorsque vous travaillez avec des protéines à faible concentration (le titrage peut aider ; profitez de l’eau ultra pure pour diluer).
  • Est-ce que toute votre famille peut surcharger Western blot ?

    La grande majorité liée à l’anticorps IP peut saisir de manière non spécifique l’anticorps de reconnaissance. IP avec cette quantité minimale normalement associée aux anticorps pour éviter la surcharge de gel et utiliser exactement une incubation prolongée si recommandée. Nous vous recommandons de ne pas utiliser plus de 10 à 20 µg d’anticorps IP en contraste tout autour de chaque voie/puits pour éviter la surcharge.

    L’introduction était trop courte

  • Augmentez le nombre de jours d’exposition (testez plusieurs jours ou semaines pour déterminer la durée d’exposition optimale).
  • L’anticorps sauf reconnaît les protéines natives

  • Dépendez vraiment des protéines reconstituées et dénaturées si vous développez une vie avec des anticorps qui ne détectent que les protéines natives.
  • Les cibles ont un poids moléculaire inférieur aux cibles standard

  • Réduire le temps de changement pour éviter les transferts excessifs. Le transfert humide est recommandé pour les protéines saines secondaires, ainsi que pour les membranes équipées de pores de plus petite taille (0,2 μm contre 0,45 μm)
  • L’azoture de sodium provoque des bactéries

  • L’azide de sodium (souvent utilisé pour stocker des anticorps universels) inhibe l’activité HRP. Assurez-vous qu’un linge particulier est suffisamment lavé pour perdre l’azide de sodium, ou prenez des tampons de sel de mer sans azide.
  • UNE

    Fond uniforme élevé

    Blocage insuffisant

  • Optimisez légèrement le temps et/ou la température de blocage.
  • Augmentez les quantités de réactifs (essayez d’augmenter la concentration de réactif vers 10 %).
  • Envisager de remplacer l’agent de blocage (lait au lieu de BSA)
  • Inclure les bloqueurs facultatifs contenus dans les tampons d’anticorps (peut également être gonflé en pourcentage).
  • Bloc incompatible

  • Non recommandé concernant la détection des protéines phosphorylées (le lait et donc la caséine sont riches en phosphoprotéines)
  • Liaison non spécifique pour garantir une concentration élevée d’anticorps

  • Réduire la concentration avec la clé ou la solution secondaire (peut aider) le titrage)
  • Contient le véritable agent bloquant le tampon d’anticorps.
  • Confirmez le signe de vente de l’anticorps secondaire en modifiant l’anticorps secondaire : omettez l’anticorps substantiel et incubez le blot tout en n’ayant que l’anticorps légitime.
  • Lavage insuffisant indiquant des anticorps non liés

  • Augmentez le nombre et/ou la durée des lavages.
  • Membrane sèche

  • Assurez-vous que la couche de tissu ne se déshydrate jamais pendant le protocole Western Blot.
  • Pourquoi mes transferts européens ne fonctionnent-ils pas ?

    Vous avez peut-être utilisé un bon complètement différent Effacer les paramètres de filtre pour la reconnaissance. Assurez-vous que votre famille a réparé l’appareil pour mesurer ces longueurs d’onde correctes. En fait, le temps sous les feux de la rampe peut ne pas suffire chaque fois que vous photographiez cet endroit particulier. Essayez de rendre le spot avec un temps d’expertise plus long.

    Adhérence du film trop longue

  • Raccourcir le temps de rencontre (peut être nécessaire pour interroger un large éventail de vos temps d’exposition).
  • Les réactifs de détection sont en fait trop sensibles

  • Diluer ce réactif de détection particulier dans de l’eau propre, éventuellement utiliser un réactif de reconnaissance moins sensible.
  • UNE

    Bandes manquantes/mauvaise taille ou éventuellement une gamme de rayures

    Protéine cible en dessous du seuil de liaison non spécifique

  • Chargement des protéines ajoutées et plus dans SDS-PAGE vers le gel réel
  • Enrichir les protéines immunosuppressives à faible teneurPrécipitation réalisée par fractionnement
  • Dégradation de l’échantillon

  • Utiliser des lysats frais
  • Conservez le contrôle sur la glace juste avant l’activateur d’obstacle de l’échantillon et faites bouillir.
  • Toujours inclure ici les inhibiteurs de la protéase en combinaison avec les inhibiteurs de la phosphatase lorsqu’une cible phosphorylée est détectée.
  • D’autres isoformes de belles protéines peuvent être présentes

  • L’épissage alternatif, souvent appelé formation de multimères, peut vous être utile. Cela devrait nécessiter un anticorps spécifique à l’isoforme.
  • Parfois, des développements post-traductionnels peuvent être présents

  • La charge moléculaire prévue peut être améliorée par de nombreuses circonstances, telles que l’utilisation pointant vers la glycosylation, la phosphorylation et le traitement des protéines (en supposant que le sein passe de la préforme à la forme). Pour examiner la spécificité, exécutez des contrôles positifs, tels qu’un lysat recombinant ou parfois un lysat surexprimant une protéine de santé, un lysat knockdown/knockout exprimant une sous-expression, en plus des contrôles négatifs.
  • UNE

    Fond tourbillonnant tacheté

    Manipulation incorrecte de la membrane exacte

  • Minimiser le contact en combinaison avec toute la membrane. Utilisez des outils propres pour pratiquer quelque chose avec la membrane.
  • Pollution tampon

  • Créer les tampons les plus récents
  • Bulles d’air

  • Retournez complètement les gels pour la peau et la membrane entre les ampoules avant de les transférer.
  • Agrégation HRP

  • Filtrez ces anticorps supplémentaires avec un filtre de 0,2 pour éliminer les agrégats.
  • western blot sds net page dépannage

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