Cosa Causa Ogni Errore Di Pagina SDS Western Blot E Anche Come Risolverlo

Se qualcuno ha una pagina di risoluzione dei problemi di Western Blot SD sul tuo computer, questa pubblicazione potrebbe essere d’aiuto.

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Possibili cause tra cui Western Blotting e raccomandazioni per l’assenza di bande Verificare che dopo la consegna riuscita delle proteine ​​separate ad alcune membrane, si percepisca una leggera colorazione di Ponceau. Ridurre il fattore di diluizione uno per essere in grado di ottenere uno o un anticorpo secondario; Completa la maggior parte degli anticorpi riutilizzabili e prova ad aggiornare.

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Quali contributori sbiadiscono le bande in SDS-PAGE?

Possono verificarsi bande ondulate, incerte o talvolta diffuse come quando le proteine ​​sono carenti, le persone ottimiste che legano le proteine ​​allo strato di membrana è basso, è sempre stata dimostrata una fluttuazione della pressione tra il nostro riempitivo e la membrana durante il trasferimento e persino il trasferimento, la proteina un particolare peso molecolare è decisamente ottimizzata.

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RISOLUZIONE DEI PROBLEMI

La seguente guida alla risoluzione dei problemi ha generalmente lo scopo di spiegare le cause esatte e le possibili soluzioni a problemi molto comuni che si verificano durante la traduzione che sarà l’Occidente.

Aggiornato

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  • Nessun segnale o segnale stanco

    Concentrazione di anticorpi primari troppo bassa

  • Aumentare la concentrazione esatta degli anticorpi primari (una seria titolazione dovrebbe aiutare). Il Novus Concentration Antibody Kit può essere utilizzato per aumentare la nostra concentrazione di anticorpi primari.
  • Portare i campioni da cova a 4°C durante la notte.
  • Se l’anticorpo o addirittura l’anticorpo viene riutilizzato per troppi anni, qualsiasi concentrazione anticorpale efficace potrebbe rivelarsi troppo bassa; utilizzare un anticorpo fresco per poter amplificare il segnale
  • Anche la concentrazione proteica target dovrebbe essere bassa

  • Caricare più proteine ​​​​nel pozzo esatto (la titolazione può probabilmente aiutare)
  • Utilizza il loro lisato di attività positiva che esprime la vera proteina bersaglio, un lisato sovraesprimente, forse una proteina ricombinante.
  • Assicurati che il particolare tampone di lisi sia uno dei tamponi di parangon per la proteina bersaglio; Il tampone di lisi differisce a seconda, direi, del centro di localizzazione delle proteine.
  • Se necessario, attingere all’immunoprecipitazione o al frazionamento (come il frazionamento nucleare) per aumentare la concentrazione in una proteina che non è abbondante.
  • Includere gli inibitori della proteasi nel tampone di lisi
  • Assicurati che un particolare campione non sia stato danneggiato.
  • Il trasferimento che punta alle proteine ​​dal gel a queste membrane alla fine non è riuscito

  • Se necessario, confermare esattamente chi sono le proteine ​​che sono state spostate con successo sulla membrana colorando quelle membrane con macchie poco attraenti di Ponceau o Coomassie, indicando il gel.
  • Conferma il vecchio trasferimento leggendo il download riduce la stampa.
  • Gli anticorpi primari e legittimi diventano incompatibili

  • Assicurati che l’anticorpo aggiuntivo anti-specie possa essere generato nello stesso momento di quello primario.
  • (ad esempio, nell’anticorpo primario è stato ottenuto partendo dai topi, in questo caso utilizzare un forte anticorpo secondario anti-topo)
  • La scelta dello strato di tessuto non era l’ideale

  • Controllare l’idrofobicità/idrofilia dalla sequenza antigenica. Le membrane in PVDF funzioneranno probabilmente meglio con antigeni idrofili/polari/caricati, anche quando la nitrocellulosa potrebbe funzionare meglio offrendo antigeni idrofobici/non polari
  • Ci sono problemi di blocco

  • Bloccare troppo a lungo può mascherare molti epitopi e fermare il legame degli anticorpi; Riduci l’incubazione dei blocchi o magari concentrati anche sui blocchi risolti nel tempo.
  • Scegli la loro esclusiva soluzione di blocco
  • Eccessivo lavaggio direi della membrana

  • I reagenti di rilevamento possono diventare inattivi per il tempo di copertura. Assicurarsi che i reagenti siano freschi. Un anticorpo alternativo può generalmente essere testato applicandolo alla membrana vera e propria e incubando la macchia che include il reagente di rilevamento.
  • Utilizzare reagenti molto più riservati quando si lavora con proteine ​​possibilmente a basse concentrazioni (la titolazione può essere d’aiuto; indossare acqua ultrapura per diluire).
  • Gli acquirenti possono sovraccaricare il Western blot?

    La stragrande maggioranza verso l’anticorpo IP può sparare in modo non specifico all’anticorpo di riconoscimento. IP con questa particolare quantità minima normalmente associata considerando gli anticorpi per evitare il sovraccarico di gel e in termini semplici utilizzare un’incubazione prolungata se raccomandata. Si consiglia di non utilizzare più per 10-20 µg di anticorpi IP in ogni corsia/pozzetto per evitare il sovraccarico.

    L’aspetto dell’introduzione era troppo breve

  • Aumenta il numero utilizzando i giorni di esposizione (verifica più appuntamenti per determinare il tempo di esposizione ottimale).
  • L’anticorpo riconosce solo le proteine ​​native

  • Consumare davvero proteine ​​ricostituite e denaturate se cucini da vivere con anticorpi che rilevano solo le proteine ​​native.
  • I target hanno un peso molecolare inferiore rispetto ai target standard

  • Riduci il tempo di percorrenza per evitare trasferimenti eccessivi. Il wet blotting è consigliato per la proteina secondaria necessaria, così come per le membrane lavorando con pori di dimensioni inferiori (0,2 μm da 0,45 μm)
  • La sodio azide provoca i batteri

  • La sodio azide (spesso usata per immagazzinare gli anticorpi iniziali) inibisce l’attività dell’HRP. Assicurati che il bucato più importante sia lavato a sufficienza da eliminare la sodio azide o il consumo di pastiglie di sale marino senza azide.
  • UN

    Sfondo molto uniforme

    Blocco insufficiente

  • Allunga leggermente il tempo di blocco e/o la temperatura.
  • Aumenta il concentrato di reagente (prova ad aumentare la concentrazione di reagente fino al 10%).
  • Valutare la possibilità di sostituire l’agente bloccante (latte come sostituto del BSA)
  • Includi i bloccanti facoltativi contenuti nei tamponi anticorpali (può anche essere coltivato in percentuale).
  • Blocco incompatibile

  • Non raccomandato inteso per la rilevazione di proteine ​​fosforilate (il latte così come la caseina quindi sono ricche di fosfoproteine)
  • Legame non specifico per garantire un’elevata concentrazione di anticorpi

  • Ridurre la concentrazione con la soluzione principale o secondaria (può aiutare) la titolazione)
  • Contiene un nuovo fantastico agente bloccante il tampone anticorpale.
  • Confermare l’approvazione dell’anticorpo secondario influenzando l’anticorpo secondario: omettere l’anticorpo iniziale e incubare la macchia con solo l’anticorpo legittimo.
  • Lavaggio insufficiente per quanto riguarda gli anticorpi non legati

  • Aumenta il numero e/o il tempo dei lavaggi.
  • Membrana asciutta

  • Assicurarsi che lo strato di tessuto non si disidrati mai durante il protocollo Western Blot.
  • Perché le mie macchie americane non funzionano?

    Potresti aver utilizzato un particolare completamente diverso Cancella le impostazioni del filtro per la prognosi. Assicurati che la tua famiglia abbia installato il dispositivo per misurare le lunghezze d’onda corrette. In effetti, il tempo di irritazione potrebbe non bastare se magari si riprende questa particolare location. Prova a consigliare il posto con un tempo di responsabilità più lungo.

    L’adesione della pellicola è troppo lunga

  • Ridurre il tempo di esposizione immediata (potrebbe essere necessario sperimentare un’ampia gamma di tempi di esposizione diretta).
  • I reagenti di rilevamento sono in realtà troppo sensibili

  • Diluire tutto il reagente di rilevamento in acqua pulita o, talvolta, utilizzare un reagente di riconoscimento meno sensibile.
  • UN

    Strisce mancanti/taglia sbagliata o eventualmente righe di varietà

    Proteina target al di sotto della soglia di legame non specifico

  • Caricamento di altre e più proteine ​​in SDS-PAGE per quanto riguarda il gel vero e proprio
  • Arricchire proteine ​​immunosoppressive a basso contenutoPrecipitazione per frazionamento
  • Degrado del campione

  • Usa lisati freschi
  • Mantieni il pezzo sul ghiaccio appena prima dell’attivatore dello scudo del campione e fai bollire.
  • Includi sempre inibitori della proteasi come parte della combinazione con inibitori della fosfatasi ogni volta che viene rilevato un bersaglio fosforilato.
  • Potrebbero essere presenti altre isoforme proteiche del vigore

  • Lo splicing alternativo, forse noto come formazione di multimeri, ti è utile. Ciò potrà richiedere un anticorpo specifico per l’isoforma.
  • A volte possono essere presenti variazioni post-traduzionali

  • Il peso molecolare eccessivo previsto può essere migliorato da molti elementi, come l’uso a causa della glicosilazione, fosforilazione e elaborazione delle proteine ​​(assumendo il seno dalla preforma alla forma). Per mostrare la specificità, esegui controlli positivi, ad esempio un lisato ricombinante o talvolta un lisato che sovraesprime la salute, un lisato knockdown/knockout downesprimendo, come parte dell’aggiunta ai controlli negativi.
  • UN

    Sfondo screziato o semplicemente vorticoso

    Maneggio errato di tutta la membrana

  • Riduci al minimo il contatto in combinazione con ciascuna delle nostre membrane. Usa strumenti puliti per iniziare a fare qualcosa con la membrana.
  • Inquinamento da buffer

  • Crea francobolli più recenti
  • Bolle d’aria

  • Capovolgere attentamente i gel per la pelle ma la membrana tra le fiale prima del trasferimento.
  • Aggregazione HRP

  • Filtra questi anticorpi legittimi con un filtro 0.2 per eliminare gli aggregati.
  • Risoluzione dei problemi del modulo sds western blot

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