SDS Western Blot 페이지 오류의 원인과 해결 방법

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웨스턴 블로팅의 가능한 원인 및 밴드 없음에 대한 권장 사항 일반적으로 분리된 단백질을 멤브레인으로 성공적으로 옮긴 후 약간의 Ponceau 염색이 관찰되는지 확인합니다. 이 특정 희석 인자를 2차 항체와 함께 1:1로 줄이십시오. 대부분의 다용도 항체를 완성하고 새로고침해 보세요.

<배열><본체>

관련 링크

서부 스키 가이드

문제 해결 가이드

권장 다운로드 컨트롤

샘플 준비

western blot sds 웹사이트 페이지 문제 해결

SDS 페이지 고정

겔의 단백질을 막으로 이동

면역 얼룩 및 탐지

막 청소 및 단순 재탐색

SDS-PAGE에서 기절 밴드의 원인은 무엇입니까?

물결 모양의 약하거나 때때로 확산되는 밴드는 단백질이 결핍될 때 나타날 수 있습니다. 단백질의 막에 대한 양성 결합이 가장 낮습니다. 전달 또는 전달하는 동안 항상 우리 자신의 젤과 일종의 막 사이에 압력 변화가 있었습니다. 각 단백질 특정 분자량은 거의 확실히 최적화됩니다.

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문제 해결

아래의 문제 해결 가이드는 대부분의 경우 서양으로 번역할 때 발생하는 일반적인 문제에 대한 가능한 해결 방법을 설명하기 위한 것입니다.

업데이트됨

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  • 신호가 없거나 약한 신호

    1차 항체 인식이 너무 낮음

    <문자열>

  • 일차 항체와 관련하여 실제 농도를 높입니다(적정이 도움이 되어야 함). Novus Concentration Antibody Kit는 1차 항체와 함께 농도를 높이는 용도로만 사용할 수 있습니다.
  • 부화 표본을 밤새 4°C까지 올릴 수 있습니다.
  • 모항체가 항상 너무 많이 재사용되는 경우 유용한 항체 농도가 너무 낮을 수 있습니다. 새로운 항체를 사용하여 신호 증폭
  • 목표 단백질 농도는 항상 낮습니다.

    <문자열>

  • 더 많은 단백질을 확실하게 로드(적정이 도움이 될 수 있음)
  • 목표 단백질을 발현하는 양성 게임 용해물, 과발현 용해물 또는 주요 재조합 단백질을 사용합니다.
  • 용해 완충액이 표적 단백질과 관련된 최적의 완충액 중 하나로 간주되는지 확인하십시오. lysis barrier는 protein localization 중심에 따라 다릅니다.
  • 필요한 경우 풍부하지 않은 건강한 단백질의 농도를 증가시키기 위해 면역침전 잠재적 분획(예: 원자 분획)을 사용합니다.
  • 용해 완충액과 관련하여 프로테아제 억제제 포함
  • 모든 특정 샘플이 손상되지 않도록 하십시오.
  • 겔의 단백질을 막으로 옮기는 것은 물론 실패했습니다.

    <문자열>

  • 필요한 경우 젤을 가리키면서 Ponceau 또는 Coomassie 얼룩이 있는 막을 염색하여 건강한 사람이 사람의 막으로 성공적으로 전이되었는지 확인합니다.
  • 다운로드 제어 출력물을 읽고 동일한 전송을 확인합니다.
  • 1차 항체와 합법적인 항체는 호환되지 않습니다.

    <문자열>

  • 일반적인 1차 항체와 동시에 추가 항종 항체가 생성되었는지 확인하십시오.
  • (예를 들어, 1차 항체를 마우스에서 얻은 경우 이 경우 항마우스 보조항체를 사용)
  • 막의 선택이 반드시 이상적이지는 않았습니다.

    <문자열>

  • 특정 항원 서열의 소수성/친수성을 확인합니다. PVDF 멤브레인은 친수성/극성/하전 항원에 대해 더 만족스럽게 작동할 수 있지만 니트로셀룰로오스는 소수성/비극성 항원에 더 잘 작동할 수 있습니다.
  • 차단 문제가 있을 수 있습니다.

    <문자열>

  • 너무 오래 차단하면 많은 에피토프를 덮고 항체 결합을 억제할 수 있습니다. 잠금 인큐베이션을 줄이거나 해결된 시간 차단에 집중하세요.
  • 해결책에 반대하는 독특한 작업
  • 막의 과도한 세척

    <문자열>

  • 탐지 시약은 시간이 지남에 따라 비활성화됩니다. 시약이 신선한지 확인하십시오. 멤브레인에 적용하고 검출 시약과 함께 블롯을 배양하기만 하면 대체 항체를 테스트할 수 있습니다.
  • 낮은 양의 단백질을 다루는 훨씬 더 민감한 시약을 사용합니다(적정이 도움이 될 수 있습니다. 희석하려면 초순수를 사용하십시오).
  • Western blot에 과부하를 줄 수 있습니까?

    대다수의 IP 항체는 평판 항체를 비특이적으로 포착할 수 있습니다. 일반적으로 항체와 관련된 최소 금액의 IP를 사용하여 젤 과부하를 주의하고 권장되는 경우 시간이 많이 걸리는 배양을 사용합니다. 과부하를 피하기 위해 대략 모든 레인/웰에서 IP 항체에서 10-20 µg 이하를 사용하는 것이 좋습니다.

    소개 이미지가 상당히 짧았습니다.

    <문자열>

  • 노출 일수를 늘립니다(최적의 노출 시간을 이해하기 위해 여러 번 테스트).
  • 항체는 천연 단백질만 감지합니다.

    <문자열>

  • 고유 단백질만 감지하는 항체로 생활 방식을 만든다면 실제로 재구성된 추가 변성 단백질을 사용하십시오.
  • 대상은 표준 대상보다 분자 지방이 낮습니다.

    <문자열>

  • 과도한 전송을 방지하는 데 도움이 되는 전송 시간을 줄입니다. Wet blotting은 2차 단백질에 권장되며, 피부 구멍 크기가 더 작은 막(0.2μm 대 0.45μm)의 경우에도 마찬가지입니다.
  • 아지드화나트륨은 박테리아를 유발합니다.

    <문자열>

  • Sodium azide(종종 일반 항체를 저장하기 위해 사용)는 HRP 활성을 억제합니다. 세탁물이 씨 아지드를 제거할 수 있을 정도로 충분히 세탁되었는지 확인하거나 아지드가 없는 씨 나트륨 패드를 사용하십시오.
  • 높은 균일한 배경

    불충분한 차단

    <문자열>

  • 절단 시간 및/또는 온도를 약간 높입니다.
  • 시약에 대한 인식을 높입니다(시약 농도를 10%까지 높여 보십시오).
  • 좋은 차단제 사용(BSA 대신 우유)
  • 항체 완충액에 포함된 선택적 차단제를 포함합니다(해당 비율로 증가할 수도 있음).
  • 호환되지 않는 차단

    <문자열>

  • 인산화된 단백질과 관련된 검출에는 권장되지 않음(우유와 현재 카제인은 인단백질이 풍부함)
  • 고농도 항체를 확보해야 하는 경우 비특이적 결합

    <문자열>

  • 주 용액 또는 적법한 용액으로 전체 농도 감소(도움이 될 수 있음) 적정
  • 항체 차폐 차단제 함유
  • 고교 항체를 조작하여 2차 항체의 징후를 의심할 여지 없이 확인합니다. 1차 항체를 생략하고 정직한 항체로만 blot을 배양합니다.
  • 결합되지 않은 항체의 불충분한 세척

    <문자열>

  • 세탁 횟수 및/또는 시간을 늘립니다.
  • 건조막

    <문자열>

  • Western Blot 프로토콜 동안 멤브레인이 절대 탈수되지 않도록 하십시오.
  • 왜 내 웨스턴 블롯이 거의 작동하지 않습니까?

    탐지를 위해 정말 다른Clear 필터 설정을 사용했을 수 있습니다. 가족이 가장 적합한 파장을 측정할 수 있는 일종의 장치를 설정했는지 절대적으로 확인하십시오. 실제로 특정 위치의 유형을 촬영할 때는 노출 시간이 충분하지 않을 수 있습니다. 더 긴 노출 시간으로 결정을 렌더링해 보십시오.

    필름 본드가 너무 깁니다.

    <문자열>

  • 노출 작업 시간을 단축합니다(광범위한 노출 시간을 테스트하는 데 필요할 수 있음).
  • 검출 시약은 실제로 너무 민감할 수 있습니다.

    <문자열>

  • 진단 시약을 깨끗한 물에 희석하거나 덜 민감한 검출 시약을 사용하십시오.
  • 스트라이프 누락/잘못된 시스템 또는 다중 스트라이프 가능성

    비특이적 결합 임계값을 더욱 낮추는 표적 단백질

    <문자열>

  • 진정한 젤의 SDS-PAGE에 점점 더 많은 단백질을 로딩
  • 저함량 면역억제 단백질 강화 분획으로 인한 침전
  • 샘플 분해

    <문자열>

  • 신선한 용해물 사용
  • 샘플 버퍼 활성화제 직전에 극지방 환경에 샘플을 보관하고 결과적으로 끓입니다.
  • 큰 인산화된 표적이 감지되면 항상 인산분해효소 억제제와 함께 프로테아제 억제제를 포함하십시오.
  • 다른 건강 아미노산 동형이 존재할 수 있음

    <문자열>

  • 다합체 형성으로 추정되는 대체 접합도 유용할 수 있습니다. 이를 위해서는 모든 동형 특이적 항체가 필요할 수 있습니다.
  • 가끔 번역 후 수정 사항이 있을 수 있음

    <문자열>

  • 예측된 분자량은 단백질 처리는 말할 것도 없고 글리코실화, 인산화 사용과 같은 많은 요인에 의해 개선된 상태를 유지할 수 있습니다(do에서 형태로의 절단을 가정). 특이성을 확인하기 위해 음성 대조군과 함께 실제 재조합 용해물 또는 때때로 단백질 과발현 용해물, 녹다운/녹아웃 다운발현 용해물과 같은 양성 대조군을 강화하십시오.
  • 얼룩이 있거나 소용돌이치는 배경

    막의 잘못된 취급

    <문자열>

  • Membrane과 결합하여 연결을 최소화합니다. 멤브레인이 있는 작업을 하려면 깨끗한 도구를 사용하십시오.
  • 버퍼 오염

    <문자열>

  • 새 스탬프 만들기
  • 기포

    <문자열>

  • 이송할 때 피부 젤과 앰플 사이의 멤브레인 층을 완전히 앞쪽으로 뒤집습니다.
  • HRP 집계

    <문자열>

  • 이 2차 항체를 0.2 필터로 필터링하여 응집체를 제거합니다.
  • 웨스턴 흡수 sds 페이지 문제 해결

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