Wat Veroorzaakt De SDS Western Blot-paginafout En Hoe Deze Te Verhelpen

Als je een Western Blot SD-probleemoplossingspagina hebt op een individuele computer, kan deze handleiding je misschien helpen.

U kunt uw laptop of desktop in slechts enkele minuten repareren, zonder dat u vaardigheden vereist. Klik hier om te zien hoe.

Mogelijke oorzaken van Western Blotting en aanbevelingen voor geen banden Controleer, want na succesvolle overdracht van de uit de eiwitten weggenomen eiwitten naar het membraan, wordt een lichte Ponceau-kleuring waargenomen. Verminder hun verdunningsfactor één tot één of extra antilichaam; Voltooi de meeste herbruikbare antilichamen en probeer ook te verfrissen.

Verwante links

Westerse tuimelgids

Handleiding voor het oplossen van problemen

Aanbevolen downloadopties

Monstervoorbereiding

western blot sds squeeze pagina probleemoplossing

SDS-pagina bevriezen

Overdracht van eiwitten van basis naar membraan

Immunoblot en detectie

Reinigen en opnieuw testen van het membraan

Wat veroorzaakt vage sieraden in SDS-PAGE?

Golvende, zwakke of soms rustige banden kunnen verschijnen wanneer eiwit echt tekort is, de positieve binding van noodzakelijk aan het membraan laag is, waar er altijd drukschommelingen zijn geweest die variëren van onze eigen gel en de membraanlaag tijdens overdracht of overdracht, het welzijn eiwitten is een bepaald molecuulgewicht duidelijk geoptimaliseerd.

Opslag overzetten

Laat bijna alle logs zien

PROBLEEMOPLOSSING

De onderstaande gids voor het oplossen van problemen wordt algemeen beschouwd als uitleg over de oorzaken en mogelijke oplossingen voor veelvoorkomende problemen die optreden bij het vertalen naar het Westen.

Bijgewerkt

Bent u het beu dat uw computer traag werkt? Geërgerd door frustrerende foutmeldingen? Reimage is de oplossing voor jou! Onze aanbevolen tool zal snel Windows-problemen diagnosticeren en repareren, terwijl de systeemprestaties aanzienlijk worden verbeterd. Dus wacht niet langer, download Reimage vandaag nog!

  • 1. Download Reimage
  • 2. Start het programma
  • 3. Klik op "Nu scannen" om eventuele virussen op uw computer te vinden en te verwijderen

  • Geen signaal of zwak signaal

    Primaire antilichaamconcentratie te laag

  • Verhoog de werkelijke concentratie van de belangrijkste antilichamen (dtitratie zou moeten helpen). De Novus Concentration Antibody Kit kan worden aangebracht om de concentratie van initiële antilichamen te verhogen.
  • Hoog het uitgekomen exemplaar een nacht op tot 4°C.
  • Als het oorspronkelijke antilichaam te vaak wordt hergebruikt, kan een goede antilichaamconcentratie te laag zijn; werk met vers antilichaam om het specifieke signaal te versterken
  • Doeleiwitconcentratie is ook laag

  • Nog meer eiwit in de put laden (titratie kan waarschijnlijk gemakkelijk helpen)
  • Gebruik een positief tijdverdrijflysaat dat het doeleiwit tot expressie brengt, elk lysaat met overexpressie, of een recombinant eiwit.
  • Zorg ervoor dat de lysisbuffer op zijn beurt een van de optimale buffers is voor elk doeleiwit; De lysisbuffer varieert afhankelijk van het centrum van de vereiste lokalisatie.
  • Gebruik indien nodig immunoprecipitatie, mogelijk fractionering (zoals atomaire fractionering) om de concentratie van een eiwit te laten groeien dat niet overvloedig is.
  • Inclusief proteaseremmers die lysisbuffer doen
  • Zorg ervoor dat een voorbeeld niet bedorven wordt.
  • Overdracht van eiwitten van hoe de gel naar het membraan uiteindelijk faalde

  • Bevestig indien nodig dat de eiwitten zeker met succes zijn overgebracht naar de weefsellaag door het membraan te kleuren met Ponceau- of Coomassie-vlekken, wijzend op de gel.
  • Bevestig dezelfde overdracht door de afdruk van de downloadcontrole te bekijken.
  • Primaire en sterke antilichamen zijn onverenigbaar

  • Zorg ervoor dat het specifieke aanvullende anti-species-antilichaam op hetzelfde moment als het meest waardevolle antilichaam werd gegenereerd.
  • (Als het meest waardevolle antilichaam bijvoorbeeld is verkregen van muizen, gebruik dan in dit richtsnoer een legitiem antilichaam tegen muizen)
  • De keuze van het membraan was verre van ideaal

  • Controleer de hydrofobiciteit/hydrofiliciteit van de antigene cyclus. PVDF-membranen werken mogelijk beter met hydrofiele/polaire/geladen antigenen, hoewel nitrocellulose het misschien beter doet met hydrofobe/niet-polaire antigenen
  • Er zijn stopproblemen

  • Te lang blokkeren kan een aantal epitopen maskeren en antilichaambinding remmen; Verminder de incubatie van sloten of focus op de hoeveelheid tijd die nodig is voor het oplossen van blokkeringen.
  • Ga voor een unieke gênante oplossing
  • Overmatig wassen van het membraan

  • Detectiereagentia zullen na verloop van tijd waarschijnlijk inactief worden. Merk gespecificeerd dat de reagentia vers zijn. Een substitutie-antilichaam kan worden getest door het op het membraan te installeren en bovendien de blot te incuberen met het ontdekkingsreagens.
  • Gebruik veel gevoeligere reagentia wanneer u met eiwitten in lage concentraties mit werkt (titratie kan helpen; gebruik ultrapuur water om te verdunnen).
  • Kun je Western Blot overbelasten?

    De overgrote meerderheid van het IP-antilichaam kan het blootstellingsantilichaam niet-specifiek vangen. IP met de minimale hoeveelheid op een natuurlijke manier geassocieerd met antilichamen om overbelasting van de base te voorkomen en gebruik indien aanbevolen eenvoudig uitgewerkte incubatie. We raden aan om niet meer dan 10-20 µg IP-antilichamen in ongeveer elke baan/putje te gebruiken en overbelasting te vermijden.

    Intro-afbeelding was te kort

  • Verhoog het aantal dagen van onmiddellijke blootstelling (test meerdere keren om de beste blootstellingstijd te bepalen).
  • Het antilichaam herkent alleen naturelle eiwitten

  • Gebruik echt gereconstitueerd en gedenatureerd vlees als je leeft van antilichamen die alleen inheemse eiwitten detecteren.
  • Doelen hebben een lager molecuulgewicht dan standaarddoelen

  • Verkort de overdrachtstijd om overmatige overdrachten te voorkomen. Wet blotting is betrouwbaar voor secundaire eiwitten, maar ook voor membranen met kleinere poriën (0,2 m vs. 0,45 m)
  • Natriumazide kan bacteriën veroorzaken

  • Natriumazide (vaak gebruikt om generieke antilichamen op te slaan) remt HRP-verkeer. Zorg ervoor dat het wasgoed voldoende is geleegd om het zee-azide te verwijderen, of gebruik azidevrije zee-zeepads.
  • EEN

    Hoge uniforme achtergrond

    Onvoldoende blokkering

  • Verhoog de blokkeertijd en/of temperatuur iets.
  • Verhoog de reagensconcentratie (probeer de reagensconcentratie te verhogen tot 10%).
  • Overweeg het verstoppingsmiddel te vervangen (melk in plaats van BSA)
  • Voeg voorgestelde blokkers toe in antilichaambuffers (kan bovendien worden verhoogd als uw percentage).
  • Blokkeren incompatibel

  • Niet aanbevolen voor detectie in gefosforyleerde eiwitten (melk en daarom caseïne over het algemeen rijk aan fosfoproteïnen)
  • Niet-specifieke binding om een ​​hoge concentratie antilichamen te garanderen

  • Verminder de aandacht met de hoofd- of secundaire opname (kan helpen) titratie)
  • Bevat een verstoppingsmiddel voor de antilichaambuffer.
  • Bevestig de indicatie van het aanvullende antilichaam door het alternatieve antilichaam te manipuleren: laat het primaire antilichaam weg en incubeer als gevolg de blot met alleen het betrouwbare antilichaam.
  • Onvoldoende wassen van ongebonden antilichamen

  • Verhoog het aantal en/of de duur van de wasbeurten.
  • Droog membraan

  • Zorg er inderdaad voor dat het membraan nooit uitdroogt binnen het Western Blot-protocol.
  • Waarom werken mijn western blots meestal niet?

    Het kan heel goed zijn dat je een heel andere instelling hebt gebruikt om de zuiveringsinstellingen te wissen voor detectie. Zorg ervoor dat de betreffende familie de tool heeft ingesteld om de juiste golflengten te meten. In feite is de belichtingstijd misschien helemaal niet genoeg bij het fotograferen van deze specifieke locatie. Probeer de plek te renderen met een langere belichtingstijd.

    Film hecht tegelijkertijd lang

  • Verkort de belichtingstijd (kan vaak nodig zijn om een ​​brede productlijn van belichtingstijden te testen).
  • Detectiereagentia zijn strikt te gevoelig

  • Verdun het detectiereagens tijdens schoon water of gebruik een minder gevoelig detectiereagens.
  • EEN

    Strepen ontbreken/verkeerde maat of mogelijk meerdere strepen

    Doeleiwit lager dan niet-specifieke bindingsdrempel

  • Het laden van steeds meer noodzakelijke eiwitten in SDS-PAGE van de echte gel
  • Verrijk immunosuppressieve eiwitten met een laag gehalte Precipitatie door fractionering
  • Voorbeeld degradatie

  • Gebruik nieuw geoogste lysaten
  • Bewaar het monster uitsluitend op ijs voordat de activator van de monsterbuffer en bovendien kook.
  • Voeg altijd proteaseremmers toe in combinatie met de fosfataseremmers wanneer een gefosforyleerd middel wordt gedetecteerd.
  • Andere isovormen van gezondheidseiwitten kunnen ook aanwezig zijn

  • Alternatieve splicing, ook wel multimeervorming genoemd, kan handig zijn om ervoor te zorgen dat u zeker bent. Hiervoor kan één isovorm-specifiek antilichaam nodig zijn.
  • Soms zijn er post-translationele wijzigingen aanwezig

  • Het voorspelde molecuulgewicht kan worden vervangen door vele factoren, zoals een soort gebruik van glycosylering, fosforylering en gezonde eiwitverwerking (uitgaande van splitsing van voorvorm tot uiteindelijk vorm). Voer, om de specificiteit te bevestigen, sterke controles uit, zoals een recombinant lysaat en/of misschien soms eiwit dat lysaat tot overexpressie brengt, knockdown/knock-out tot downexpressie brengend lysaat, naast verkeerde controles.
  • EEN

    Gevlekte of wervelende achtergrond

    Onjuist gebruik van het membraan

  • Minimaliseer contact gevonden in combinatie met het membraan. Gebruik volledig schoon gereedschap om iets met het eigenlijke membraan te doen.
  • Buffervervuiling

  • Maak nieuwe postzegels
  • Luchtbellen

  • Draai deze huidgels en het membraan in de ampullen volledig om voordat u ze overbrengt.
  • HRP-aggregatie

  • Filter deze secundaire antilichamen met een 0.2-filter om aggregaten te verwijderen.
  • western mark sds-pagina probleemoplossing

    Als u op zoek bent naar een manier om uw pc te repareren, hoeft u niet verder te zoeken. Reimage is een alles-in-één oplossing die u kan helpen virussen en malware te verwijderen, uw systeemprestaties te verbeteren, Windows-registerfouten te herstellen en meer.