Vad Som Orsakar SDS Western Blot Page Error Och Hur Man åtgärdar Det

Om du har en speciell Western Blot SD-felsökningssida efter din dator, skulle den här guiden säkert hjälpa.

Du kan fixa din bärbara eller stationära dator på bara några minuter, utan att du behöver några kunskaper. Klicka här för att se hur.

Möjliga orsaker till Western Blotting och rekommendationer för inga band Verifiera att efter framgångsrik överföring av de mycket separerade proteinerna till membranet observeras försumbar Ponceau-färgning. Minska hela utspädningsfaktorn en till en, sekundär antikropp; Komplettera de flesta multi-användningsantikroppar och försök att uppdatera.

Relaterade länkar

Västerländsk skidguide

Felsökningsguide

Rekommenderade nedladdningskontroller

Provberedning

western blot sds fanpage felsökning

Frys SDS-sida

Överföring av proteiner direkt från gel till membran

Immunblot och detektion

Rengöring och återprobning av membranet

Vad orsakar små band i SDS-PAGE?

Vågiga, svaga eller normalt diffusa band kan uppträda när välbefinnandeproteiner är bristfälliga, den positiva bindningen mellan proteiner till membranet är på en minskad nivå, det har alltid funnits tryckvariation mellan vår egen gel och vanligtvis membranet under överföring eller överföring, den mest viktigt protein en viss molekylvikt bör definitivt optimeras.

Överför lagringsutrymme

Visa nästan alla loggar

FELSÖKNING

Felsökningsguiden nedan är huvudsakligen avsedd att förklara orsakerna och dessutom möjliga lösningar på vanliga problem som uppstår vid översättning till väst.

Uppdaterad

Är du trött på att din dator går långsamt? Irriterad av frustrerande felmeddelanden? Reimage är lösningen för dig! Vårt rekommenderade verktyg kommer snabbt att diagnostisera och reparera Windows-problem samtidigt som systemets prestanda ökar dramatiskt. Så vänta inte längre, ladda ner Reimage idag!

  • 1. Ladda ner Reimage
  • 2. Kör programmet
  • 3. Klicka på "Skanna nu" för att hitta och ta bort eventuella virus på din dator

  • Ingen signal eller svag signal

    Primär antikroppsinnehållsnivå för låg

  • Öka den faktiska koncentrationen kopplad till primära antikroppar (dtitrering bör hjälpa). Novus Concentration Antibody Kit kan användas för att öka koncentrationen kopplade primära antikroppar.
  • Höj det kläckande provet så att det blir 4°C över natten.
  • Om moderantikroppen kommer att återanvändas för många gånger, kan eventuell välmående antikroppskoncentration vara för låg; använd färsk antikropp för att amplifiera signalen, vanligtvis
  • Målproteinkoncentrationen är ibland låg

  • Att ladda mer protein i själva (titrering kan förmodligen hjälpa)
  • Använd ett positivt aktivitetslysat som uttrycker målets välmående, ett överuttryckande lysat eller ett lämpligt rekombinant protein.
  • Se till att lyseringsbufferten verkligen är en av de optimala buffertarna utformade för målproteinet; Lysbelastningen skiljer sig beroende på centrum för en proteinlokalisering.
  • Om nödvändigt, använd immunfällning alternativt fraktionering (som atomfraktionering) för att öka koncentrationen av en hälsa som inte är riklig.
  • Inkludera proteashämmare i bara lyseringsbuffert
  • Se till att just ditt prov inte är bortskämt.
  • Överföringen av proteiner från gelén till membranet misslyckades en gång för alla

  • Om det behövs, bekräfta att aminosyrorna har överförts till hela membranet genom att färga membranet med Ponceau- eller Coomassie-färger och peka på gelén.
  • Bekräfta samma överföring från att läsa nedladdningskontrollutskriften.
  • Primära och som en konsekvens legitima antikroppar är inkompatibla

  • Se till att idén att den extra anti-artantikroppen konstruerades samtidigt som den specifika primära.
  • (om huvudantikroppen till exempel erhölls från möss, i närheten av detta fall, använd en antimus och en andra uppsättning antikroppar)
  • Valet av membran var definitivt inte idealiskt

  • Kontrollera hydrofobiciteten/hydrofilicitet för den viktigaste antigensekvensen. PVDF-membran kan fungera mycket bättre med hydrofila/polära/laddade antigener, även om nitrocellulosa fungerar bättre med hydrofoba/icke-polära antigener
  • Det finns utan tvekan blockeringsproblem

  • Blockering för länge kan täcka många epitoper och hämma antikroppsbindning; Minska låsinkubation eller fokus inom tid löst blockering.
  • Sök efter en unik sammandragningslösning
  • Överdriven tvättning av membranet

  • Detektionsreagenser kan mycket väl bli inaktiva med tiden. Se till att reagenserna är färska. En alternativ antikropp kan testas eftersom man applicerar den på membranet och till och med inkuberar blotten med detektorreagenset.
  • Använd mycket känsligare reagens den andra som arbetar med proteiner vid låga koncentrationer av mit (titrering kan hjälpa; använd ultrarent med vatten att späda ut).
  • Kan du överbelasta Western blot?

    Den stora majoriteten av IP-antikroppen kan icke-specifikt fånga detektions- och förståelseantikroppen. IP med den lägsta avgift som normalt är förknippad med antikroppar för att komma ur gelöverbelastning och använd helt enkelt justerad inkubation om det rekommenderas. Vi rekommenderar att inte ha mer än 10-20 µg associerade IP-antikroppar i ungefär en bana/brunn för att undvika överbelastning.

    Introbilden var alldeles för kort

  • Öka antalet dagar för exponeringen (testa flera gånger för att ta reda på optimal exponeringstid).
  • Antikroppen upptäcker endast naturliga proteiner

  • Använd verkligen rekonstituerade såväl som denaturerade proteiner om du har levt med antikroppar som bara upptäcker lokala proteiner.
  • Mål har ett lägre molekylärt kroppsfett än standardmål

  • Minska överföringstiden för att undvika överdrivna överföringar. Wet blotting anses vara rekommenderat för sekundära proteiner, liksom för membran med mindre hudporstorlekar (0,2 μm mot 0,45 μm)
  • Natriumazid orsakar bakterier

  • Natriumazid (används ofta i stor utsträckning för att lagra generiska antikroppar) hämmar HRP-aktivitet. Se till att tvätten kan tvättas tillräckligt för att ta bort saltaziden, eller använd azidfria havsnatriumkuddar.
  • A

    Hög enhetlig bakgrund

    Otillräcklig blockering

  • Öka igensättningstiden och/eller temperaturen något.
  • Öka reagensets kroppsrörelser (försök att öka reagenskoncentrationen till 10%).
  • Överväg att ersätta med blockeringsmedel (mjölk istället för BSA)
  • Inkludera valfria blockerare som finns i antikroppsbuffertar (kan också ökas i procent).
  • Block inkompatibelt

  • Rekommenderas inte för detektionsrelaterade fosforylerade proteiner (mjölk och vilket betyder att kasein är rikt på fosfoproteiner)
  • Icke-specifik bindning för att säkerställa hög koncentration av antikroppar

  • Minska, skulle jag säga, koncentrationen med huvud- eller tilläggslösningen (kan hjälpa) titreringen)
  • Innehåller ett antikroppshinderblockerande medel.
  • Bekräfta indikationen på sekundär antikropp genom att manipulera den extra antikroppen: utelämna den primära antikroppen som inkubera blotten med endast den professionella antikroppen.
  • Otillräcklig tvättning av obundna antikroppar

  • Ökning du ser, antalet och/eller varaktigheten av tvättar.
  • Torrt membran

  • Se till att membranet du aldrig ska torka ut under Western Blot-protokollet.
  • Varför fungerar utan tvekan inte mina westernblots alls?

    Du kan ha använt en mycket annorlunda Rensa filterinställningar för upptäckt. Gör utan tvekan att din familj har ställt in alla enheter för att mäta de exakta våglängderna. Faktum är att exponeringstiden sannolikt inte kommer att räcka till när du fotograferar dem på en viss plats. Försök att återge platsen med en längre exponeringstid.

    Filmbandet är för långt

  • Förkorta exponeringen en tid (kan behövas för att testa ett stort antal exponeringstider).
  • Detektionsreagenser skulle faktiskt vara för känsliga

  • Späd ut sensorernas reagens i rent vatten, eller använd ett definitivt mindre känsligt detektionsreagens.
  • A

    Ränder saknas/fel intervall eller möjligen flera ränder

    Målprotein lägre än ospecifik bindningströskel

  • Laddar in mer och proteiner i SDS-PAGE för den eventuella gelén
  • Berika immunsuppressiva proteiner med låg halt Utfällning från fraktionering
  • Provnedbrytning

  • Använd färska lysat
  • Behåll provet vid snöfall precis innan provbuffertaktiveraren och koka helt enkelt.
  • Inkludera alltid proteashämmare i kombination med fosfatashämmare när ett fosforylerat mål detekteras.
  • Andra hälso-essentiella proteinisoformer kan förekomma

  • Alternativ skarvning, även känd som multimerbildning, kan vara mycket användbar för dig. Detta kan kräva en större isoformspecifik antikropp.
  • Ibland kan du vara närvarande efter översättningsändringar

  • Den förutsagda molekylvikten kan förbättras av många faktorer, till exempel användningen av glykosylering, fosforylering, dessutom proteinbearbetning (förutsatt klyvning från do till form). För att bekräfta specificiteten, gå till positiva kontroller, såsom ett rekombinant rekombinant lysat eller ibland protein överuttryckande lysat, knockdown/knockout neduttryckande lysat, utöver negativa kontroller.
  • A

    Fläckig eller virvlande bakgrund

    Felaktig hantering av membranet

  • Minimera namn i kombination med membranet. Använd rena verktyg för att göra något som lider av membranet.
  • Bufferföroreningar

  • Skapa nya stämplar
  • Luftbubblor

  • Vänd en hudgel och vävnadslagret mellan ampullerna helt innan överföringen.
  • HRP-aggregation

  • Filtrera dessa sekundära antikroppar med ett specifikt 0,2-filter för att ta bort aggregat.
  • felsökning av western bare sds page

    Om du letar efter ett sätt att fixa din dator behöver du inte leta längre. Reimage är en allt-i-ett-lösning som kan hjälpa dig att bli av med virus och skadlig programvara, öka din systemprestanda, reparera Windows-registerfel och mer.

    Western Blot Sds Page Troubleshooting
    Dépannage De La Page Western Blot Sds
    Solução De Problemas De Página De Western Blot Sds
    Rozwiązywanie Problemów Ze Stroną Western Blot SD
    Western Blot Sds 페이지 문제 해결
    Устранение неполадок со страницей Western Blot Sds
    Fehlerbehebung Auf Der Western Blot Sds-Seite
    Solución De Problemas De La Página Western Blot Sds
    Risoluzione Dei Problemi Della Pagina Sds Western Blot